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 技術前沿 
技術前沿
CircFOXK2通過與RNA結合蛋白復合并摻入海綿MiR-942促進胰腺導管腺癌的生長和轉移
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-04-08 | 579 次瀏覽 | 分享到:
2020年3月26日,香港中文大學的陳揚超研究員在Cancer Reasearch(IF=8.378,中科院1區)雜志上發表了一篇題為‘CircFOXK2 Promotes Growth and Metastasis of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Complexing with RNA Binding Proteins and Sponging MiR-942’的文章。該研究揭示了circFOXK2通過miRNA海綿和與RBP(RNA bingding protein)結合共同調控胰腺導管腺癌的生長和轉移。

胰腺導管腺癌(PDAC)是美國和歐洲癌癥死亡的第四大主要原因。手術,化學療法和放射療法是PDAC的標準療法。不幸的是,PDAC患者只能將生存期延長至幾個月。此外,將吉西他濱與其他化療藥物如nab-紫杉醇聯合使用只能提供有限的生存期延長,并且產生包括白細胞減少癥和周圍神經病變在內的不良反應,因此,迫切需要治療PDAC的新型治療靶點。



1、PDAC細胞中circRNA的鑒定



為了鑒定PDAC中差異表達的circRNA,作者對非腫瘤人胰管上皮細胞(HPDE)和PDAC細胞進行了circRNA測序,共鑒定出17,158個circRNA。與非腫瘤HPDE細胞相比,在PDAC細胞中有83個上調的circRNA和86個下調的circRNA。隨后本研究對PDAC細胞和原發性腫瘤中circRNA的表達進行驗證,發現circFOXK2在PDAC細胞以及63%的PDAC原發性腫瘤顯著上調。

圖1 PDAC中circFOXK2的特征


circFOXK2由FOXK2基因的外顯子2和3的反向剪接形成,并通過向外發散引物和向內收斂引物以及Sanger測序驗證了circFOXK2的反向剪接位點。另外,circFOXK2耐RNase R。由于缺乏polyA尾巴,寡聚dT引物引起的逆轉錄效率降低也證明了circFOXK2是環狀RNA。通過測量circFOXK2在細胞質和細胞核中的水平來檢查其定位,發現circFOXK2在PDAC細胞的細胞質中富集。編碼潛能分析表明circFOXK2缺乏蛋白質編碼能力。


圖2 circFOXK2促進PDAC細胞中的細胞生長、遷移和侵襲




2、
circFOXK2促進細胞生長和侵襲



為了闡明circFOXK2在PDAC中的功能,本研究使用了專門針對circFOXK2反向拼接接頭的小干擾RNA siRNA,它不改變其親本基因的表達。敲除circFOXK2可抑制PDAC細胞的生長和克隆能力。Annexin V染色,PARP和caspase 3的裂解以及Bcl-2水平的降低也證明了在PDAC細胞敲低circFOXK2后誘導了凋亡。敲低circFOXK2后也抑制了細胞遷移和侵襲。本研究也使用sh-circFOXK2慢病毒系統穩定敲除circFOXK2,發現circFOXK2的敲除可抑制細胞生長,克隆形成能力和侵襲性。在HPDE細胞中過表達circFOXK2顯著促進了細胞的生長,遷移和侵襲。另外,敲除circFOXK2可顯著抑制腫瘤生長,并抑制PDAC向肝轉移。

圖3 circFOXK2促進PDAC細胞中的腫瘤生長和肝轉移




3、
circFOXK2相互作用的miRNA的鑒定


接下來,作者研究了PDAC中circFOXK2的詳細機制。由于許多細胞質circRNA充當microRNA海綿,因此作者檢查了circFOXK2是否可以充當microRNA海綿。首先,作者通過TargetScan進行了生物信息學分析,揭示了circFOXK2上潛在的microRNA結合位點。為了驗證circFOXK2-microRNA的相互作用,通過使用circFOXK2-熒光素酶報告基因和miRNA模擬物的熒光素酶報告基因,表明miR-942模擬物降低了熒光素酶活性,并且突變miR-942結合位點可恢復螢光素酶活性。生物素標記的miR-942模擬物可顯著富集PANC-1細胞中的circFOXK2。這些結果表明,circFOXK2與miR-942在PDAC細胞中相互作用。


圖4 circFOXK2充當miR-942海綿


為了研究circFOXK2-miR-942在PDAC中相互作用的功能,作者首先敲低了circFOXK2,發現miR-942的表達水平升高,表明circFOXK2抑制了PDAC中miR-942的活性。另外,作者分析了miR-942在PDAC中的作用。miR-942在PDAC細胞和原發性腫瘤中下調,且轉染miR-942模擬物可抑制PDAC細胞中的細胞生長和克隆能力,說明了miR-942在促進PDAC細胞生長中的作用。


由于circFOXK2充當miR-942的miRNA海綿,因此在敲除或過表達circFOXK2后檢測miR-942靶標基因ANK1、GDNF和PAX6的表達水平。結果發現,敲除circFOXK2會降低PDAC細胞中ANK1、GDNF和PAX6的表達水平,而circFOXK2的過表達會促進HPDE細胞中ANK1,GDNF和PAX6的表達。通過引入miR-942模擬物可以挽救circFOXK2過表達對GDNF和PAX6的影響。同樣,在敲除circFOXK2的小鼠腫瘤中,ANK1、GDNF和PAX6表達水平下調。對PDAC原發腫瘤的分析揭示了circFOXK2,ANK1和PAX6表達水平之間呈正相關??傊?,circFOXK2抑制了miR-942,進而促進了PDAC中ANK1、GDNF和PAX6的表達。


圖5 circFOXK2在PDAC中促進miR-942靶標的表達




4、
circFOXK2通過復合YBX1和hnRNPK促進致癌蛋白的表達


許多研究已經表明circRNA通過充當miRNA海綿發揮了主要作用,而circRNA與蛋白質結合調節基因表達的作用仍然不確定。因此,作者接下來研究了PDAC中circRNA-蛋白質的相互作用。作者在體外轉錄了circFOXK2,通過質譜測定與circFOXK2相互作用的蛋白,共鑒定94個circFOXK2相互作用蛋白。同時,在STRING數據庫中分析了circRNA相互作用蛋白的蛋白相互作用發現101互作的個蛋白。

圖6  PDAC中circFOXK2相互作用蛋白的鑒定


隨后,作者在PDAC細胞中進行RNA免疫沉淀測定以驗證質譜分析的結果,發現circFOXK2被YBX1和hnRNPK顯著富集。由于YBX1與hnRNPK形成復合物可調控基因表達以促進PDAC進程,因此作者假設circFOXK2與YBX1和hnRNPK復合體相互作用促進PDAC的發育。敲除circFOXK2后,YBX1與hnRNPK復合體靶標NUF2和PDXK被下調,而circFOXK2下拉則顯著富集了NUF2和PDXK。通過敲低YBX1和hnRNPK可以挽救circFOXK2過表達對NUF2和PDXK表達的影響。敲除circFOXK2可降低YBX1和hnRNPK與NUF2和PDXK的相互作用。而且,敲除NUF和PDXK顯著抑制了PDAC細胞的生長和侵襲。結果表明,circFOXK2,YBX1和hnRNPK復合物相互作用并促進了PDAC中致癌蛋白NUF2和PDXK的表達。


圖7 circFOXK2在PDAC的發展和進程中的作用的示意圖



參考文獻
1. Wong HC, Lou UK, Li Y, et al. 2020. circFOXK2 promotes growth and metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma by complexing with RNA binding proteins and sponging miR-942. Cancer Research. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-19-3268.



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