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 技術前沿 
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Molecular Cancer | circRNA調控miRNA成熟和進入外泌體增強大腸癌侵襲轉移
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-04-02 | 672 次瀏覽 | 分享到:

絕大多數大腸癌(CRC)相關的死亡都是由癌細胞轉移所致,然而關于原發性CRC中轉移起始細胞的具體特征和潛在機制仍知之甚少,環狀RNA是否參與其中也未充分闡明。2020年3月18日,一項由中山大學腫瘤防治中心謝丹教授團隊帶來的研究發表在Molecular Cancer[1],此項研究發現circLONP2通過調節miR-17的細胞內成熟和細胞間轉移,在CRC發展過程中充當關鍵的轉移起始分子,從而傳播原發部位的轉移起始能力和加速其他器官的轉移形成,說明circLONP2可作為CRC治療的有效預后指標或新型抗轉移治療靶標。



與傳統的miRNA Sponge模型不同,本文中發現circLONP2是通過影響miR-17成熟和進入外泌體的效率調控了miRNA在細胞間的傳遞,進而影響了大腸癌(CRC)的轉移侵襲作用。文中對circLONP2在CRC中的生成機制,調控miR-17生成及轉運的機制做了深入的探索分析,為circRNA與miRNA相互調控關系提供了新的思路和借鑒案例,本文的機制也再次驗證了circRNA與蛋白相互作用的研究價值。


1. CRC
中轉移其實亞群怎么分選和鑒定的?
研究者應用transwell篩選方法,建立了具有不同轉移潛能的CRC亞群:高轉移潛能細胞(HM)、低轉移潛能細胞(LM)、正常親本CRC細胞(N)。再次通過體內尾靜脈注射模型驗證、體外遷移侵襲驗證、CCK-8增殖檢測及EMT標志物的WB檢測驗證了各亞群的侵襲能力和其他特征,確定了在不影響EMT標志物的情況下轉移潛能顯著增強的原發性CRC轉移起始亞群。


2.
circLONP2CRC轉移起始亞群中高表達
隨后研究者通過高通量測序和RT-qPCR檢測篩選出在CRC各亞群中差異表達、且同時在CRC的轉移起始亞群和已確定轉移的病變組織中上調的hsa_circ_0008558circLONP2)。

研究者通過反向剪切序列的Sanger測序、RNase R和放線菌素D處理耐受性驗證、oligo dT引物檢測沒有poly-A,鑒定了circLONP2;并通過FISH實驗發現circLONP2主要定位于細胞核。同時,研究者也探討了circLONP2的翻譯潛能,通過構建eGFP融合的circLONP2過表達質粒,發現質粒轉染后不能翻譯出GFP蛋白。


1 circLONP2CRC轉移起始亞群中上調. [1]

通過Transwell分析法篩選具有不同轉移能力的CRC亞群. [1]


3. 高表達circLONP2CRC患者的癌轉移及預后更差

研究者通過對97個原發性CRC組織的circLONP2表達水平檢測,同時根據circLONP2表達水平對128CRC患者進行生存分析,發現circLONP2在晚期CRC組織中的表達顯著增加,circLONP2的高表達與患者不良預后相關。隨后通過組織FISH檢測發現circLONP2CRC轉移部位的侵襲邊緣明顯過表達,且circLONP2在轉移性肝癌組織中的表達明顯高于相對的原發性CRC組織。


3 circLONP2CRC患者的癌轉移及不良預后相關. [1]

 

4. FUS調控circLONP2的生成
研究者通過預測分析比對到與circLONP2側翼內含子高度匹配的反向互補序列I7RCMI11RCM, RT-qPCRNorthern Blot結果顯示具有完整的I7RCM、I11RCMcircLONP2線性全長序列質??梢栽诩毎酗@著過表達circLONP2。
進一步探討circLONP2生成的潛在機制,研究者預測到FUS可能與circLONP2的側翼區域結合從而調控circLONP2的表達。為了驗證該猜想,研究者先在兩種CRC細胞(DLD-1、HCT116)中敲低FUS基因,發現circLONP2表達下調;且通過anti-FUS RIP檢測到I7RCMI11RCM顯著富集。隨后分析發現原發性CRC組織中circLONP2的表達與FUSmRNA水平呈顯著正相關,FUSmRNA表達也與臨床病理特征及患者的不良預后顯著相關。


4 FUS調控circLONP2的生物發生1. [1]


5 FUS調控circLONP2的生物發生2. [1]

 

5. circLONP2CRC轉移的重要因素
研究者在兩種CRC細胞(DLD-1、HCT116)中過表達和敲低circLONP2,transwell遷移侵襲實驗結果表明體外過表達circLONP2能夠增強CRC細胞的遷移侵襲能力,體外敲低circLONP2則結果相反。同時尾靜脈注射模型也驗證了體內過表達circLONP2能夠增強CRC細胞轉移至肺的潛能,體內敲低circLONP2則結果相反。


6 circLONP2CRC轉移重要因素. [1]

 

6. circLONP2通過與DDX1直接結合來增強CRC的侵襲能力
研究者通過pulldown蛋白銀染差異條帶的質譜分析以及KEGG分析,找到了可能與circLONP2相互作用、且與RNA加工和修飾相關的蛋白DDX1、DDX5DDX17,并通過pulldown蛋白產物的WB檢測驗證了DDX1、DDX5DDX17circLONP2的相互作用。

研究者為了進一步研究
DDX1直接與circLONP2相互作用的確切區域,構建了帶FLAG標簽的DDX1的野生型質粒及截短突變型質粒,通過
anti-FLAG RIP實驗證明了SPRY結構域對于DDX1circLONP2的相互作用最重要。
隨后研究者通過rescue實驗證明了DDX1對于circLONP2增強CRC細胞的遷移能力至關重要。


7 circLONP2DDX1直接結合. [1]


8 篩選與circLONP2相互作用的潛在蛋白質. [1]

 

7. circLONP2DDX1協同調控pri-miR-17的加工
由于circLONP2DDX1能夠協同促進CRC遷移,而DDX1可以調節特定miRNA亞型的成熟,因此研究者推測circLONP2可能參與了miRNA的加工。為了驗證該猜想,研究者篩選出circLONP2DDX1的潛在共同靶點miR-17。隨后在CRC細胞中分別敲低circLONP2DDX1,發現circLONP2DDX1通過調節pri-miRNA的加工來介導成熟miRNA的下調。

為了進一步探討
circLONP2DDX1調節pri-miR-17加工的潛在機制,研究者通過突變circLONP2pri-miR-17結合位點,驗證了circLONP2可以促進pri-miR-17的加工。隨后通過circ
RIP實驗(circLONP2特異性探針調?。?、pri-miR-17探針進行pulldown實驗,驗證了circLONP2pri-miR-17的相互作用。

 

8. circLONP2DDX1依賴性方式將DGCR8募集到pri-miR-17
研究者通過IP實驗證明了DDX1DGCR8以不依賴RNA的方式相互作用,RNA pulldown結果表明DDX1介導circLONP2DGCR8之間的相互作用,RIP結果表明circLONP2介導pri-miR-17DDX1DGCR8之間的相互作用。結合上文已驗證結果,說明circLONP2可以直接與pir-miR-17結合,并通過DDX1間接募集DGCR8/Drosha微處理器,從而促進pri-miR-17的成熟。

研究者通過
rescue實驗驗證了miR-17能夠增強CRC細胞遷移和侵襲能力,同時發現
miR-17-5p在晚期CRC組織中表達顯著增加,且與circLONP2的表達及不良預后相關,在轉移性肝癌組織中表達也高于原發性CRC組織,說明miR-17-5pcircLONP2驅動的CRC轉移中的有致癌作用。


9 circLONP2DDX1協同調控pri-miR-17的加工1. [1]


10 circLONP2DDX1協同調控pri-miR-17的加工2. [1]

 

9. circLONP2通過外泌體的高轉移潛能驅動的miR-17-5p細胞間轉移
研究者發現高轉移潛能細胞(HM)及circLONP2過表達的CRC細胞均有顯著增強的遷移和侵襲能力,而使用GW4869抑制外泌體分泌則大大扭轉了這種影響。隨后鑒定了CRC細胞中提取的外泌體,檢測到外泌體中miR-17-5p的顯著富集。進一步驗證了miR-17-5p可以通過外泌體轉移到受體細胞,并且發現miR-17-5p外泌體可以影響受體細胞中miR-17-5p靶標基因PTEN的表達。

研究者發現
circLONP2過表達增加了外泌體的數量和miR-17-5p的水平,circLONP2敲低則相反;而circLONP2過表達和敲除均不影響外泌體分泌相關蛋白RAB27ARAB27B的表達。說明circLONP2控制的外泌體分泌過程有著復雜調控網絡。

研究者還發現
miR17-5p外泌體增強了CRC細胞遷移和侵襲能力,且去除從circLONP2過表達的細胞中提取的外泌體后,受體細胞的高轉移潛能可以維持至少5天。說明circLONP2驅動的外泌體包裝和miR-17-5p的轉移在受體細胞中誘導了可持續的高轉移潛能。


11 circLONP2通過外泌體的高轉移潛能驅動的miR-17-5p細胞間轉移. [1]


12 外泌體miR-17-5p傳播高轉移潛能. [1]


參考文獻

1. Han K., et al., circLONP2 enhances colorectal carcinoma invasion and metastasis through modulating the maturation and exosomal dissemination of microRNA-17. Mol Cancer. 2020 Mar 18; 19(1): 60.

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